伴隨著抗生素在養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)療業(yè)的大量使用，抗生素抗性基因(antibioticresistancegenes，ARGs)污染逐漸被人們重視。近年來我國浙江、上海、廣東、河北等多個地區(qū)均有報道存在不同程度的抗生素抗性基因污染。盡管國內(nèi)外對于抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移、去除開展了大量研究，但多局限于實驗室內(nèi)模擬階段，工程實踐方面報道較少，尤其對于抗生素抗性基因含量高于生活污水且低于養(yǎng)殖廢水的屠宰廢水，在污水處理工程中去除和累積情況未見報道。為此深入研究屠宰廢水中抗生素抗性基因在污水處理各工藝中去除與累積效果，對于優(yōu)化廢水處理工藝和控制抗生素抗性基因污染具有重要現(xiàn)實意義。
本研究以2種磺胺類抗性基因(sul1、sul2)和3種四環(huán)素類抗性基因(tetA、tetB和tetC)為研究對象，研究了其在屠宰廢水處理工程中各個環(huán)節(jié)的絕對含量和相對豐度變化情況，以期尋找到最佳的抗生素抗性基因處理工藝，為相關(guān)企事業(yè)單位優(yōu)化設(shè)計污水處理工藝提供理論依據(jù)，為浙江省“五水共治”提供技術(shù)支持。
1材料與方法
1.1水樣來源：水樣樣品來源于浙江中法農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司屠宰廢水處理工程，其工程按流程包括3000m3 厭氧沼氣池、3600m3 潛流人工濕地、3600m3氧化塘和18hm2 表面流人工濕地等4個主要處理環(huán)節(jié)。按照廢水處理流程選取了屠宰廢水原水(即厭氧沼氣池入水，采樣點編號W1)、厭氧沼氣池出水(即潛流人工濕地入水，采樣點編號W2)、潛流人工濕地出水(即氧化塘入水，采樣點編號W3)、氧化塘出水(即表面流人工濕地入水，采樣點編號W4)、表面流人工濕地出水(即工程最終出水，采樣點編號W5)等5個采樣點，樣品常溫采集，保存于4℃環(huán)境，采樣時間為2014年6月至2016年5月，每月下旬采樣1次。
1.2實驗試劑：TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffe、MgCl2、dNTP、DNAMarker、6×DNALoadingDye、10×TAE、土壤基因組DNA快速抽提試劑盒、溴化乙錠、柱式DNA膠回收試劑盒、一步法快速感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，以上均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。pMD 18-TVector，購于寶生物工程(大連)有限公司。引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.3試驗儀器：潔凈工作臺、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、高速冷凍離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、微型電泳槽、PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀、紫外分光光度計、微量移液器、3730XL測序儀、LightCycler480SoftwareSetup。
1.4試驗方法：
1.4.1DNA抽提:依照土壤基因組DNA快速抽提試劑盒說明書操作。
1. 4.2標(biāo)準(zhǔn)品制備:
1.4.2.1普通PCR:PCR反應(yīng)體系25μL：模板DNA0.5μL，引物F(10μmol/L)0.5μL，引物R(10μmol/L)0.5μL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，TaqBuffer(10×)2.5μL，MgCl2(25mmol/L)2μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，H2O18.3μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 3min;變性94℃30s，退火56℃ 30s，延伸72℃ 30s，修復(fù)延伸72℃ 8min，循環(huán)數(shù)35。
1.4.2.2：PCR電泳2% 瓊脂糖凝膠，1×TAE，150V，100mA，20min電泳觀察(圖1)。
1.4.2.3PCR回收依照柱式DNA膠回收試劑盒說明操作。1.4.2.4克隆測序連接反應(yīng)10μL：Solution5μL，pMD18-TVector10ng，PCRProduct5μL，4℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化依照一步法快速感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒說明操作。質(zhì)粒提取依照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒說明操作。
1.4.2.5定量質(zhì)粒信息:構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定無誤后用紫外分光光度計測定質(zhì)粒D260nm的值，通過公式換算成拷貝數(shù)(copies/μL)。10倍梯度稀釋構(gòu)建好的各質(zhì)粒，90μL稀釋液+10μL質(zhì)粒，做4～6個點，通過預(yù)試驗選取合適標(biāo)準(zhǔn)品用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4.3熒光定量PCR檢測反應(yīng)體系見表1，
PCR循環(huán)條件見表2。完成后，把加好樣品的96/384 孔板放在LightCycler480SoftwareSetup(Roche)中進(jìn)行反應(yīng)。
2結(jié)果與分析
由表3可見，5種抗生素抗性基因sul1、sul2、txtA，txtB和txtC在屠宰場廢水原水中均有檢出，其平均絕對含量分別為5.18×105、1.48×105、6.71×105、5.77×103 和9.77×105copies/L，5種抗生素抗性基因中sul1、sul2、txtA和txtC平均絕對含量較高，說明含有sul1、sul2、txtA和txtC基因的宿主菌較含有txtB基因的宿主菌對各種環(huán)境耐受力更強(qiáng)。本次屠宰廢水抗性基因平均絕對含量與之前報道的養(yǎng)殖廢水中含量相當(dāng)，說明屠宰廢水和養(yǎng)殖廢水一樣是抗生素抗性基因主要污染源之一。
2.1厭氧處理對5種抗生素抗性基因的絕對含量和相對豐度的影響:從厭氧池進(jìn)出水中可見，水質(zhì)中sul1、sul2、txtA，txtB和txtC5種抗生素抗性基因平均絕對含量均有所下降(圖2、表3)，基于水量平衡計算可得5種抗生素抗性基因平均去除率分別為43.06%、28.35%、67.64%、31.65%和43.31%。但從5種抗生素抗性基因平均相對豐度分析(圖3、表3)
僅有txtA基因呈現(xiàn)下降趨勢，sul1、sul2、txtB和txtC基因平均相對豐度呈現(xiàn)上升趨勢，由此推斷厭氧處理可以通過減少微生物生物量降低抗生素抗性基因絕對含量，且對txtA基因有一定的處理效果，但厭氧處理可能對于sul1、sul2、txtB和txtC基因存在潛在的累積風(fēng)險。厭氧處理過程中水力停留時間(SRT)、溫度、pH值等工藝參數(shù)是否對于抗生素抗性基因降解和吸附產(chǎn)生影響，以及如何改善厭氧處理工藝流程提高對于sul1、sul2、txtB和txtC的去除效率有待進(jìn)一步研究
2.2潛流人工濕地對5種抗生素抗性基因的絕對含量和相對豐度的影響:從潛流人工濕地進(jìn)出水中可見，水質(zhì)中sul1、sul2、txtA，txtB和txtC這5種抗生素抗性基因平均絕對含量均有所上升(圖2、表3)。從基因平均相對豐度分析，sul2和txtA基因呈現(xiàn)下降趨勢，txtB和txtC基因平均相對豐度沒有明顯變化，而sul1基因平均相對豐度呈現(xiàn)上升趨勢(圖3、表3)。
上述結(jié)果說明，被測污水工程中潛流人工濕地對于sul2和txtA基因有一定去除效果，對于sul1、txtB和txtC基因沒有明顯去除能力，但由于潛流人工濕地運行引起微生物生物量增加，使得抗生素抗性基因的絕對含量呈現(xiàn)上升趨勢。一般研究報道認(rèn)為潛流人工濕地可以有效降低抗生素抗性基因的絕對含量和相對含量，但結(jié)論大多來源于實驗室模擬條件和工程實例中污水含抗生素抗性基因含量較高的情況，本次針對污水處理工程中潛流人工濕地對抗生素抗性基因檢測結(jié)果顯示，其處理效果并不理想，在污水處理工程中是否存在濕地使用時間及其他工藝運行參數(shù)影響潛流人工濕地對抗生素抗性基因去除效果有待進(jìn)一步研究。
2.3氧化塘對5種抗生素抗性基因的絕對含量和相對豐度的影響:從氧化塘進(jìn)出水中可見，水質(zhì)中sul1、sul2、txtA，txtB和txtC這5種抗生素抗性基因平均絕對含量均有所下降(圖2、表3)，計算可得氧化塘對于5種抗生素抗性基因平均去除率分別為77.59%、18.34%、82.05%、98.55%和96.82%。但出水中僅txtB和txtC基因平均相對豐度呈現(xiàn)下降趨勢，sul1、sul2和txtA這3種抗生素抗性基因平均相對豐度呈現(xiàn)上升趨勢(圖3、表3)。研究表明，氧化塘對于不同抗生素抗性基因相對豐度影響不一，joy等研究表明氧化塘可以有效降低ermB和ermF的豐度，而Barkovskii等研究認(rèn)為氧化塘處理可以降低tetB和txtL基因的相對豐度，但對tetG、tetM、tetO和txtX基因的相對豐度沒有影響甚至有所提高，究其原因可能是這些基因常位于轉(zhuǎn)移元件上，在處理過程中發(fā)生了基因的水平轉(zhuǎn)移。本次檢測結(jié)果說明，氧化塘可以通過減少微生物生物量降低抗生素抗性基因絕對含量，氧化塘工藝對于txtB和txtC基因去除效果較好，而對于sul1、sul2和txtA基因可能存在累積風(fēng)險。
2.4表面流人工濕地對5種抗生素抗性基因的絕對含量和相對豐度的影響:從表面流人工濕地進(jìn)出水中可見，水質(zhì)中sul1、sul2、txtA和txtC這4種抗生素抗性基因的平均絕對含量和平均相對豐度均呈現(xiàn)下降趨勢，4種抗生素抗性基因平均去除率分別為99.23%、98.79%、97.86%和99.63%，但txtB基因的平均絕對含量和平均相對豐度均未發(fā)生明顯變化(圖2、圖3、表3)。一般認(rèn)為表面流人工濕地可以通過吸附、過濾、氧化、沉淀、微生物分解、轉(zhuǎn)化、植物遮蔽等作用機(jī)理除去抗性基因，本次檢測結(jié)果證明了上述觀點，但本次檢測結(jié)果也表明表面流人工濕地對于絕對含量相對較低的txtB基因去除效果不佳，由于txtB基因在屠宰廢水中含量不高，因此屠宰廢水處理工程實例中可以采用表面流人工濕地作為有效降低抗生素抗性基因含量的工藝流程。
3結(jié)論與討論
從本次研究結(jié)果分析，目前，浙江中法農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司屠宰廢水處理工程可以有效去除大部分抗生素抗性基因，工程中不同的處理流程對于不同的抗生素抗性基因處理效果不同，厭氧處理工藝和氧化塘工藝可以通過減少微生物生物量有效地降低抗生素抗性基因的絕對含量，但可能存在某些抗生素抗性基因累積風(fēng)險，而表面流人工濕地對于屠宰廢水中抗生素抗性基因的絕對含量和相對豐度有有效的處理效果。研究表明，在傳統(tǒng)生物污水處理工藝基礎(chǔ)上增加消毒工藝、高級氧化工藝等深度處理工藝可以更有效地消減抗生素抗性基因含量，為此建議企業(yè)在現(xiàn)有基礎(chǔ)上增加深度處理工藝。
目前，我國對于污水中抗生素抗性基因排放并無要求，但考慮到抗生素抗性基因?qū)θ祟悗淼娘L(fēng)險，建議在經(jīng)濟(jì)條件允許的條件下，企業(yè)盡量選擇對于抗生素抗性基因處理效果好的污水處理工藝，以便應(yīng)對抗生素抗性基因污染。同時，國家相關(guān)部門應(yīng)盡快制定養(yǎng)殖業(yè)中合理使用抗生素的標(biāo)準(zhǔn)并出臺抗生素及抗生素抗性基因污染治理的政策和法規(guī)，以便規(guī)范養(yǎng)殖業(yè)健康良性發(fā)展并改善我國現(xiàn)階段污染狀況。鑒于污水工程是抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移和傳遞的重要污染源，建議未來關(guān)于抗生素抗性基因研究重點放在：(1)抗生素抗性基因環(huán)境傳播機(jī)制;(2)污水處理過程中抗生素濃度、重金屬含量及微生物群落與抗生素抗性基因的關(guān)系;(3)污水處理工藝參數(shù)對抗生素抗性基因去除和累積的影響。嘉興市是國家首批海綿城市建設(shè)試點城市，建議地方各級有關(guān)部門提高對抗生素抗性基因污染治理的重視程度，加大對于抗生素抗性基因治理應(yīng)用性研究成果的推廣力度，以便實現(xiàn)海綿城市對污染物削減率目標(biāo)，更好地為浙江省“五水共治”提供經(jīng)驗和技術(shù)支持。
來源:《江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)》 作者:劉銳
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